去除内毒素
内毒素也叫热源,一般是磷脂a、糖类和蛋白的复合分子,在中性条件下带有负电荷。
内毒素的磷脂部分有很强的疏水性,在高盐情况下会聚合,所以很少用疏水色谱,如果蛋白本身的疏水性强,可以选择把目标蛋白结合到疏水色谱填料(苯基琼脂糖凝胶FF,丁基琼脂糖凝胶FF)上和内毒素分离。但是如果蛋白疏水性不强也可以尝试能不能挂内毒素而去除。
内毒素带有很强负电荷,如果目标蛋白带阳电荷,用DEAE琼脂糖凝胶FF或Q琼脂糖凝胶FF把内毒素吸附,达到去除内毒素的目的。如果目标蛋白带阴电荷,可以尝试用阶段或梯度洗脱的方法把它们分离。
其中最有效而特异的方法是用亲和色谱填料去除内毒素,为此我们专门开发了一种专门去除内毒素的色谱填料即去内毒素亲和填料FF和高效去内毒素亲和填料FF,配基为USP级别药品,填料为药品级别的材料,配基不脱落,安全性好,可以很方便去除内毒素,其使用简便,效果明显,样品回收率高,产品可以重复使用,成本低。已广泛应用于蛋白,抗体,核酸,病毒,多糖等产品的内毒素去除,可以做到<5EU/mg或ml,方法是把适量的色谱填料加到样品中4-25度震荡20-40h左右无菌过滤就可以得到热源符合要求的样品。配基是USP级别的药品,有专门结合磷脂a位点,在使用过程不脱落,安全性好,是常规方法失效后最有效去的方法。
去除核酸
大量的核酸会使样品的粘度增加,影响传质从而影响分离效果,此外在药品检验中对核酸的含量也有严格的规定,所以去除核酸非常重要。
核酸带有阴性的电荷,可用阴离子交换色谱填料DEAE-琼脂糖凝胶 FF或Q-琼脂糖凝胶 FF 去除,也可以用阳离子色谱填料:SP-琼脂糖凝胶 FF或CM琼脂糖凝胶 FF直接把目标蛋白吸附而去除核酸。它们属于最新一代的离子交换填料,载量高,分辨率好。
在2-3M硫酸铵的条件下,RNA和DNA都可以被苯基琼脂糖凝胶FF吸附。
此外也可以用核酸酶处理样品,把核酸降解成小片段,用琼葡糖凝胶FF凝胶过滤填料就可以去除。此外也可用DNA纯化琼脂糖凝胶FF去除。
去除病毒和微生物
微生物和病毒是病原或者热源的来源,产生的酶也可能分解产物,因此要尽量去除干净。微生物可以通过严格的过滤方法控制,而病毒也可以用凝胶过滤去除,因为它们比普通的蛋白或核酸大,一般在外水体积全排阻。也可以在样品中加Triton和吐温后,再过CM或SP-琼脂糖凝胶 FF吸附目标蛋白得去除。配合各种色谱技术以及在位清洗和消毒都可以尽量减少这些病原体的污染。
|